¿Cómo hacen las proteínas solubles para ser estables en el agua sin perder reactividad, es decir, la posibilidad de interaccionar con otras proteínas? ¿Es posible tener enterradas las interacciones estructurales y simultáneamente mantener en la superficie sitios vulnerables o pegajosos? La respuesta estaría en la rugosidad superficial subnanométrica como modo de protección de regiones expuestas vulnerables y/o reactivas en proteínas

Los puentes de hidrógeno juegan un papel determinante en biología al establecer elementos esenciales de la estructura o andamiaje de las proteínas*. De hecho, Pauling y Corey descubrieron los elementos nativos de la estructura secundaria de las proteínas (la hélice α y la hoja β) maximizando el número de puentes de H intramoleculares (o del “backbone”). Ahora bien, la estructura del agua es tal que cada molécula a temperatura ambiente tiende a rodearse tetraédricamente de otras cuatro con las cuales interacciona por puentes de H, constituyendo así una red (dinámica) de puentes de H. Dada la avidez del agua por formar interacciones de puente H, las proteínas solubles deben proteger sus puentes de H intramoleculares del ataque del agua que de otro modo, al interaccionar con la cadena principal (el backbone o esqueleto) de la proteína, desmantelaría las interacciones intermoleculares de ésta desestabilizando su estructura nativa. Por lo tanto, los puentes de H de la cadena principal que se encuentran en la superficie de la proteína deben ser protegidos. El modo usual en que las proteínas llevan a cabo tal protección consiste en rodearlos o enterrarlos con sus grupos hidrofóbicos, los cuales organizan localmente al agua (pues ésta trata de excluirlos**). Este proceso ha sido denominado por el Prof. Ariel Fernández como wrapping o arropamiento. Adicionalmente, al excluir el agua (que posee una alta capacidad dieléctrica), es decir, al deshidratarse localmente o “secarse”, el puente de H nativo adquiere una importante ganancia en intensidad dado que en esta condición el dieléctrico local disminuye de manera efectiva.

Para que la protección por medio de residuos hidrofóbicos indicada sea efectiva, es necesario que el puente de H intramolecular esté rodeado de un número determinado de hidrófobos. Sin embargo, existen casos en que algunos puentes de H intramoleculares no reúnen a su alrededor ese número mínimo de hidrófobos y, por lo tanto, no pueden ser adecuadamente protegidos del agua. Estos defectos de arropamiento o de wrapping, es decir, puentes de H intramoleculares mal protegidos o también llamados dehidrones, han sido identificados por el Prof. Fernández, quien ha encontrado que resultan esenciales en la reactividad o el binding (unión o interacción con otras proteínas). Ello es debido a que resultan adhesivos o reactivos debido a su tendencia a completar su contenido hidrofóbico local para consumar su deshidratación (son, por tanto, interacciones insuficientemente satisfechas o insaturadas). Este novedoso motivo de interacción intermolecular ha exhibido una importancia fundamental en numerosos contextos, como en el diseño o modificación racional de fármacos.

De todos modos, una cuestión problemática que puede plantearse en esta descripción es la siguiente: Si bien enterrar interacciones resulta necesario para ganar la imprescindible estabilidad estructural (para permanecer “seco” en el agua) el costo implícito de una práctica exhaustiva en este sentido sería un indeseable sacrificio de reactividad. Es necesario cierto nivel de vulnerabilidad (de interacciones insaturadas, de sitios pegajosos) para que las proteínas puedan interaccionar con otras proteínas y mantener así ciertas funciones biológicas. Siendo susceptibles de ser atacados por el agua, ¿cómo se sustenta entonces la existencia de puentes de Hidrógeno mal protegidos (dehidrones) en la superficie de las proteínas? Pues si bien estos motivos estructurales son intrínsecamente inestables ante el agua, de hecho existen en la superficie proteica. La respuesta a esa paradoja, como veremos, es que la proteína, en una situación de insuficiencia en su contenido hidrofóbico local, debe echar mano a la geometría. 

Cuando comenzamos a estudiar la hidratación de proteínas por medio de simulaciones de dinámica molecular, focalizándonos en el cálculo de las distancias mínimas entre los puentes de H intramoleculares de la cadena principal de la proteína y las moléculas de agua, notamos que el agua rodea a los mismos a una distancia típica de unos 3 Angstroms (una distancia similar a la cual las moléculas de agua se disponen alrededor de superficies hidrofóbicas modelo), pero que por su parte se distancia mucho más de dehidrones (alrededor de unos 5 Angstroms). Este hecho de que el agua se aleje más de los puentes de H vulnerables a su ataque que de los bien protegidos es a priori inesperado, pero es obviamente necesario para la subsistencia de la estructura local de la proteína. La hipótesis que inmediatamente propone solucionar este dilema es la siguiente: Los puentes de H intramoleculares desprotegidos están estructurados dentro de huecos o cavidades inaccesibles al agua. Esta modulación de la rugosidad local de la superficie de la proteína debe estar finamente sintonizada de modo de aprovechar la reticencia propia del agua a perder a su esfera de coordinación (y por consiguiente los puentes de hidrógeno agua-agua): La cavidad debe ser tal que para ingresar a la misma y atacar al puente de H intramolecular, la molécula de agua debería resignar su esfera de coordinación y, por ende, sus puentes de H con otras moléculas de agua, lo cual resulta inviable debido al alto costo energético que conlleva. Ello es precisamente lo que encontramos cuando realizamos un estudio de la rugosidad superficial de proteínas ***.

Es precisamente esta protección geométrica la que permite la existencia de dehidrones en la superficie, los que de otro modo, serían vulnerables y atentarían contra la estabilidad estructural local de la proteína. Dicho nivel de rugosidad local para permanecer “seco” en el agua representa evidentemente un costo adicional para la proteína, pues no se verifica en regiones carentes de dehidrones donde el contenido hidrofóbico local es suficiente para mantener “seca” la interacción intramolecular sin necesidad de recurrir a la geometría local. Es interesante notar que el caso más extremo de este tipo de sello geométrico (de toda la amplia base de datos de proteínas analizada) lo constituye la neurotoxina del escorpión HSTX1 (1QUZ según el PDB, la cual se une al canal de potasio) en la que todos sus 17 puentes de H intramoleculares están desprotegidos hidrofóbicamente y todos ellos se encuentran en cavidades locales cuyos radios caen precisamente en el rango que prohíbe penetración del agua. De hecho, las toxinas (las más reactivas de las proteínas, con afinidades del orden picomolar) son las que presentan la mayor rugosidad superficial (los menores valores medios de curvaturas locales). En estas proteínas el agua está básicamente a unos 5 Angstroms de la superficie en vez de la típica distancia de unos 3 Angstroms y, en tal sentido, es como si se movieran dentro de una “burbuja” en el agua.

Por otra parte, para demostrar que el descripto constituye un elemento de diseño molecular de las proteínas, estudiamos asimismo conformaciones mal plegadas (misfolded) encontrando que, en dichas estructuras, el agua es capaz de aproximarse a unos 3 Angstroms de los puentes de los dehidrones y atacarlos. Es decir, estas estructuras permiten la hidratación de la cadena principal de la proteína con el consiguiente desmantelamiento de la estructura nativa. De hecho, los dehidrones se encuentran arreglados en cavidades más amplias, accesibles al agua. Es por tal motivo que dichas estructuras no subsisten en solución. Por lo tanto, resulta evidente que la adaptación geométrica superficial descripta claramente discrimina entre elementos estructurales nativos y misfolds, introduciendo de tal modo un condicionamiento físico que guía el diseño de materiales peptídicos con actividad reactiva capaces de mantener estabilidad estructural en el agua. Este concepto de diseño augura, por tanto, potencialidad en cuestiones de bio-ingeniería molecular.

Los resultados aquí expuestos representan una colaboración entre el grupo del Dr. Gustavo Appignanesi (Erica Schulz, Marisa Frechero y Gustavo Appignanesi) del INQUISUR-UNS-CONICET Bahía Blanca y el Dr. Ariel Fernández del Department of Bioengineering, Rice University, Houston y del Department of Computer Science, The University of Chicago, Chicago. Los mismos fueron publicados recientemente en el trabajo Sub-Nanoscale Surface Ruggedness Provides a Water-Tight Seal for Exposed Regions in Soluble Protein Structure”, E.P. Schulz, M.A. Frechero, G.A. Appignanesi y A. Fernández, PLoS ONE 5 (9) e12844 (2010). Esta revista de la Public Library of Science de Estados Unidos tiene una política de Open Access, por lo cual el artículo está disponible gratuitamente:

http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0012844

* PUENTES DE HIDROGENO:

Un puente de hidrógeno se produce cuando un átomo de H unido covalentemente a un átomo electronegativo (por ej, O, N) interacciona con otro átomo electronegativo. Estas interacciones son muy direccionales dado que se requiere prácticamente colinealidad entre los tres átomos indicados y distancias de interacción específicas.

Los puentes de H son, por ejemplo, las interacciones intermoleculares responsables de que el agua resulte líquida en condiciones ambientales (siendo mucho más intensos que la mayoría de las interacciones intermoleculares, pero bastante más débiles que los enlaces covalentes).

** HIDROFOBICIDAD:

Las proteínas se protegen del agua enterrando sus interacciones intermoleculares con grupos hidrofóbicos que organizan localmente al agua y le impiden así que ataque a la estructura. Ello se lleva a cabo debido a que el agua no forma interacciones favorables con un hidrófobo, con lo cual debe intentar excluirlo. Si el hidrófobo es pequeño, el agua puede excluirlo manteniendo sus moléculas los cuatro puentes de H típicos del seno de la solución o bulk formando una jaula o clatrato, pero si la superficie hidrofóbica es extensa, las moléculas de agua pierden la posibilidad de formar un puente de H en la dirección de la superficie (por lo cual reducen su número total a típicamente 3). De cualquier manera, el agua debe organizarse alrededor de los hidrofóbos (adquiriendo una estructuración local específica que los excluya), de modo que pierde libertad conformacional y, en el caso que nos ocupa, no es capaz de adquirir una conformación que comprometa al puente de H intramolecular de la proteína. Del mismo modo, la naturaleza de la “fuerza hidrofóbica” (atracción que sienten los hidrófobos entre sí en solución) es entrópica, dado que el agua intenta minimizar la superficie de contacto con los hidrófobos, tendiendo a un mínimo sacrificio conformacional: si disminuye la superficie de contacto, las moléculas de agua que se liberan desde esa región al seno de la solución ganan libertad conformacional.

*** ESTUDIO DE LA RUGOSIDAD SUPERFICIAL DE PROTEÍNAS:

Cuando analizamos una extensa base de datos de estructuras de 2661 proteínas monoméricas (cabe señalar que estudiamos directamente las estructuras del Protein Data Bank o PDB, es decir, no las simulaciones sino directamente las estructuras experimentales encontradas por RMN o RX) el resultado fue contundente: La distribución de radios de curvatura de las cavidades superficiales es subnanométrica (entre 1 y 10 Angstroms) y la porción izquierda de la distribución está casi completamente dominada por los dehidrones. Es decir, los dehidrones se forman invariablemente en cavidades inferiores a unos 3,5 Angstroms, mientras que los puentes de H bien arropados no presentan ese nivel de tan alta rugosidad local. Analizando el número de coordinación por puentes de hidrógeno de las moléculas de agua entre sí (g) y su distancia a la superficie, se encontró que para cavidades hasta unos 3.5 Angstroms de radio el agua está a unos 5 Angstroms del puente de H intramolecular de la proteína y su coordinación es de g=3. A medida que la cavidad aumenta de tamaño, el agua se aproxima, llegando hasta unos 3 Angstroms del puente de H intramolecular de la proteína (distancia a la cual podría atacarlo) cuando la cavidad tiene un radio de unos 4.5 Angstroms (el cual permite el ingreso de una molécula de agua con g=3). De todos modos, a ese tamaño de cavidad ya no se encuentran dehidrones y el puente de H intramolecular de la proteína está entonces ya protegido por el contenido local de hidrófobos. Así el agua casi en ningún caso baja su coordinación de g=3, de modo que el efecto geométrico aprovecha esta reticencia a perder coordinación para “secar” la interacción intramolecular de los dehidrones.